Cell：透视RNA病毒感染全过程，揭示早期翻译-复制动力学机制
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作者 | 华中农大CX
2020年11月23日，Cell杂志重磅刊登了来自荷兰乌得勒支大学与乌德勒支医学中心大学的研究人员开发出全新单分子成像分析（VIRIM）以研究单链正义RNA（+RNA）病毒的翻译（产生病毒蛋白），复制（产生自身RNA）动力学和病毒-宿主相互作用关系。
创新性的成像分析系统可以观察到单个病毒在细胞间翻译和复制的异质性，确定传入病毒基因组vRNA的复制是成功感染的关键，并确定了介导这种抗病毒活性的宿主基因IFIT1。
研究指出，早期小核糖核酸（RNA）病毒感染可分为五个不同的阶段；病毒RNA执行翻译和复制过程在细胞间是存在异质性的；传入vRNA（incoming viral RNA）的复制过程是宿主发挥抗病毒活性的主要目标。
概述
众所周知，虽然RNA病毒已经被广泛研究，但由于缺乏敏感的检测，对感染初期（前几个小时内）发生的过程知之甚少。为此，科研人员开发了一种单分子成像分析方法--病毒感染实时成像(viral infection real-time imaging, VIRIM)，以研究单个RNA病毒在活细胞中的翻译和复制。
大多数单链正义RNA (+RNA) 病毒基因组一旦释放到宿主细胞的细胞质中就可以直接翻译成病毒蛋白。在合成时，病毒蛋白执行各种功能，如病毒RNA (vRNA) 复制，修饰宿主细胞，以及抑制宿主细胞中的抗病毒信号。新进来的病毒（incoming RNA）在翻译后，即感染宿主细胞后，新合成的vRNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp) 产生负链RNA (-RNA，或反意义链)，又被用作合成新 (或额外的) +RNA的模板。这些新的 +RNA可以进入新一轮的翻译和复制，也可以被包装成新的传染性病毒颗粒。
在漫长的进化过程中，细胞具备了复杂的检测和对抗病毒感染的机制。包括检测RNA病毒复制过程中形成的长双链（股）RNA (double-stranded (viral) RNA, dsRNA) 的蛋白质传感器--在检测到dsRNA后，宿主快速激活天然抗病毒信号途径，如干扰素 (IFN) 诱导途径。紧接着，IFN刺激基因 (ISGs) 的上调是限制病毒繁殖的关键。同样的，病毒也会积极地对抗这些抗病毒信号通路。许多小RNA病毒产生相应的蛋白酶，以水解上述蛋白，进而防止病毒被机体检测到。此外，许多RNA病毒可以关闭宿主的翻译和转录，也可阻碍抗病毒反应的发生。
因此，病毒感染的结果很可能是由病毒翻译/复制动力学和宿主细胞抗病毒信号动力学之间的竞争决定的。有趣的是，研究人员在抗病毒信号传导方面观察到了大量的细胞间异质性，即使在同源培养的细胞群体中也是如此，这表明细胞和/或病毒的异质性可能是病毒-宿主竞争的一个重要方面。
不得不承认，大多数目前的检测方法，如western blot、PCR、免疫荧光、GFP病毒等，在感染的头几个小时对检测病毒的敏感性是不够的。第二，大多数检测需要细胞溶解或固定，因此不能提供实时测量存活状态的受感染细胞。因此，很难将感染早期发生的分子事件与感染的最终结果联系起来。第三，许多细胞通常需要一个单一的保证，这对于分析非同步状态的病毒感染动力学过程是非常有问题的。第四，大多数检测只评估病毒感染的一个参数(例如vRNA水平或病毒蛋白水平)，而非动态。
结果解析
1. 病毒翻译与复制的单分子分析
前期，实验人员开发了一种基于Sun-Tag的活细胞荧光成像系统，可在活细胞中检测单个分子。即将Sun-Tag与荧光标记的胞内单链可变区抗体STAb（可以结合Sun-Tag多肽）结合，制备共生体细胞系统。
利用肠道病毒科代表性的柯萨奇病毒B3 (CVB3)的验证实验中，在感染性克隆病毒株 (SunTag-CVB3) 的N端有5个Sun-Tag多肽重复；以低剂量病毒感染稳定表达STAb的人U2OS细胞后不久，在感染细胞中可以观察到一个或多个明亮的GFP斑点。对GFP斑点的定量分析表明，单个GFP斑点对应约90个Sun-Tag多肽。由于单个核糖体翻译vRNA仅与5个Sun-Tag相关，因此，GFP斑点数据表明许多核糖体同时翻译vRNA。当细胞在活细胞工作站观察时，可观察到单个细胞中GFP斑点的数量随着时间的推移而增加，表明病毒在不断复制。通过RdRp抑制剂--3Dpol的抑制剂，GFP斑点的增加发生强烈的减弱，进一步证实单个细胞GFP斑点数量的增加是vRNA复制的结果。
为了评估SunTag-CVB3是否具有类似于野生型CVB3的复制动力学，科研人员创新性的开发了一种不依赖于Sun-Tag的CVB3感染活细胞传感器。前期实验表明，随着CVB3的感染进程，核孔完整性受到损害，导致核和细胞质成分的交换增加。那么，是否可以利用受损的核转运过程作为感染的标志呢？科研人员将BFP融合到核定位信号 (NLS-BFP) 中并在产生STAb的细胞中稳定表达。结果显示，在感染SunTag-CVB3后，BFP从细胞核到细胞质发生明显的易位变化，尤其是在新传入的vRNA发生翻译后的几分钟内。因此，BFP易位的开始可以作为感染时刻的标志。利用NLS-BFP定位的活细胞成像，研究人员得出：野生型CVB3和SunTag-CVB3之间细胞的vRNAs数目随时间的变化是高度异质化的，但两种病毒的平均每个细胞的vRNAs数目随时间的变化是相似的，这表明将Sun-Tag插入病毒基因组不会影响早期vRNA的复制与翻译。
2. 早期感染过程中vRNA的定位和迁移
利用SunTag-CVB3，科研人员发现，在前2-3小时，没有观察到vRNA在细胞质中的任何优先定位--vRNAs在整个细胞质中迅速移动。即在感染早期，大多数vRNA不是定位于特定的亚细胞结构，而是通过（或在）细胞质自由扩散。
3. 复制的异质性和动态性
对SunTag-CVB3感染细胞的活细胞工作站成像分析显示了病毒复制的显著重复模式，包括五个不同的阶段。感染阶段1：单个GFP点的出现(MOI<1)代表新传入的vRNA的翻译。感染阶段2：没有GFP斑点产生的时期，可能代表vRNA复制(合成一个RNA，随后以RNA为模板合成多个新的+RNA)，因为vRNA的翻译过程是在其复制过程中被关闭的。第3阶段，开始于GFP点的重新出现，然后是GFP斑点的数量迅速增加，这可能是由于新合成的RNA的翻译。在第三阶段，额外的+RNA很可能是从第二阶段产生的-RNA合成的。在第4阶段，GFP斑点的数量保持不变，表明新合成的+RNA正在进行翻译，以为新一轮的复制做准备。在第4阶段，vRNA的一个子集进行复制，产生新的-RNA和随后的新+RNA。第5阶段，观察到GFP斑点的第二次快速增加，这可能反映了新增加的+RNA的合成和翻译。在第5阶段结束时，GFP先前定位于细胞质和细胞核，而后在细胞质中积累。
同时，科研人员发现，虽然在大多数转染细胞中可以观察到这五个感染时期，但单个阶段的持续时间以及每个阶段翻译vRNA的数量在细胞之间是异质的。例如，第1阶段的持续时间内就表现出了很明显的异质性--从12分钟到4小时以上。因此，所有感染阶段的细胞在任何时刻都在细胞群中共存。通过更加精确的数据分析，研究人员发现，在所有成功完成第二阶段的情况下，随后的阶段也是成功的，这表明第二阶段是病毒生命周期中最脆弱的阶段，是成功感染的关键。
4. 翻译到复制开关
科研人员发现，vRNA复制的时间不是由细胞中vRNA或病毒蛋白的数量决定的，而是由单个vRNA所固有的。与此相一致的是，当使用较高的MOI时，观察到的结果仍然与低MOI一致。
由于vRNA的复制依赖于新翻译的病毒聚合酶（viral polymerase），因此，复制本身不需要关闭翻译。在第1阶段，合成了在第2阶段对vRNA复制必不可少的复制“零件”，包括3Dpol。
5. 宿主VS病毒翻译
在病毒感染期间，许多RNA病毒会关闭宿主翻译过程。蛋白质合成速率的整体快速降低最直接反映翻译而不是转录的存在，因为蛋白质合成速率的整体下降很难通过上游的转录抑制来如此迅速地实现。进一步的研究发现，宿主关闭翻译过程发生在dsRNA存在于细胞之前（或dsRNA产生之前），因此可以预先阻止抗病毒蛋白的产生。
6. 病毒-宿主相互作用
在天然抗病毒反应（或先天性免疫反应）研究中，最显著的是IFN信号通路，尤其是在抑制大多数RNA病毒的传播中起着至关重要的作用。
虽然IFN信号对基因表达的影响已经有了很好的记录，但其对早期病毒感染的影响尚不清楚。科研人员通过用IFN 处理细胞来刺激先天抗病毒状态，并评估感染的时机、效率和异质性。随着时间的推移，IFN信号并没有改变感染细胞的比例，但感染细胞的数量有显著增加，其中新传入的vRNA在第2阶段（复制阶段）被捕获随后经历了成功的复制，且正常进展到随后的感染阶段。这些结果表明，IFN诱导的抗病毒状态主要作用于阻止传入vRNA的复制，对早期感染的其他方面几乎没有影响。
由于IFN通过上调ISGs促进抗病毒状态，科研人员进一步确定负责抑制传入vRNA复制的ISG。利用RNA测序(RNA-seq, 转录组测序技术)，实验人员鉴定了37个基因（在IFN处理U2OS细胞时上调了3倍以上），包括许多著名的抗病毒基因。在对其中测试的28个ISGs中，共筛选到了6个ISGs (IFIT1、OAS1、OAS3、STAT1、HELZ2和C19orf66)，它们的耗竭部分抵消了IFN对vRNA复制的抑制作用。同时，研究人员发现，多个ISGs的联合敲除更能减少第二阶段vRNA的复制，说明多种抗病毒机制同时作用阻断传入vRNA的复制。值得注意的是，常用的ISG蛋白激酶R (PKR) 的存在不会抑制传入vRNA的复制。进一步，IFIT1干扰RNA（siRNA）实验证实了IFIT1基因敲除的特异性。通过IFN治疗和IFIT1缺失细胞进行早期感染的活细胞分析，表明传入的vRNA的复制阶段是IFN信号抑制的关键点，再次证明IFN主要抑制传入的vRNA的复制过程。
总结
VIRIM揭示了细胞间复制动力学的显著异质性，揭示了单个病毒RNA（vRNA）的翻译和复制之间的全面协调。此外，通过VIRIM首次确定了新传入病毒RNA的复制过程是成功感染的主要瓶颈，并确定了负责抑制早期病毒复制的宿主基因。病毒感染的单分子成像分析方法是研究病毒复制和病毒与宿主相互作用的有力工具，未来可能广泛适用于RNA病毒。
参考文献：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31382-9
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